Tiangen DP117無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒用戶指南：高純度質(zhì)粒制備技術(shù)方案

一、產(chǎn)品核心特性與工作原理

1. 技術(shù)優(yōu)勢與試劑盒組成

• 核心特性：

• 高效去內(nèi)毒素：采用硅膠膜吸附技術(shù)結(jié)合去內(nèi)毒素系統(tǒng)，內(nèi)毒素去除率＞99%，殘留量＜0.1 EU/μg DNA，符合細(xì)胞轉(zhuǎn)染及動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)；

• 超螺旋結(jié)構(gòu)保留：通過溫和裂解體系（P2緩沖液）與多步離心過濾（CS1過濾器），超螺旋質(zhì)粒占比＞85%，顯著提升轉(zhuǎn)染效率；

• 高通量處理：單次可處理100-200 mL菌液，高拷貝質(zhì)粒得率達(dá)500-1500 μg，低拷貝質(zhì)粒得率200-600 μg，滿足大規(guī)模實(shí)驗(yàn)需求。

• 試劑盒組成：

• 裂解系統(tǒng)：溶液P1（含RNase A）、溶液P2（裂解液）、溶液P4（中和液）；

• 純化系統(tǒng)：平衡液BL、漂洗液PW（含無水乙醇）、無水乙醇、洗脫液TB；

• 耗材：吸附柱CP6（50 mL離心管適配）、收集管、過濾器CS1。

2. 適用范圍與兼容性

• 下游應(yīng)用：

• 常規(guī)實(shí)驗(yàn)：酶切、PCR、測序、連接、轉(zhuǎn)化；

• 實(shí)驗(yàn)：基因治療載體構(gòu)建、顯微注射、RNA干擾、CRISPR-Cas9基因編輯；

• 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：適用于內(nèi)毒素敏感型細(xì)胞（如Huh7、HEK293T）的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率較普通質(zhì)粒提升30%-50%。

• 質(zhì)粒兼容性：

• 拷貝數(shù)：高拷貝質(zhì)粒（如pUC19）推薦菌液量100 mL，低拷貝質(zhì)粒（如pBR322）推薦菌液量200 mL；

• 大小范圍：支持1-20 kb質(zhì)粒提取，對于＞10 kb大質(zhì)粒，需增加菌液量及裂解液體積。

二、典型應(yīng)用場景與實(shí)驗(yàn)方案

1. 基因治療載體構(gòu)建

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 使用DP117提取慢病毒載體骨架質(zhì)粒（如pLVX-IRES-ZsGreen1），菌液量200 mL；

2. 定量檢測濃度（OD260）及純度（OD260/OD280=1.8-2.0），瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證超螺旋結(jié)構(gòu)；

3. 結(jié)合Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率＞80%。

• 結(jié)果示例：

• 提取的質(zhì)粒濃度達(dá)1.2 μg/μL，內(nèi)毒素含量0.05 EU/μg，顯著低于普通試劑盒（＞1 EU/μg）；

• 慢病毒滴度達(dá)1×10? TU/mL，較含內(nèi)毒素質(zhì)粒提升40%。

2. CRISPR-Cas9基因編輯

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取sgRNA表達(dá)質(zhì)粒（如pX458），菌液量100 mL；

2. 通過DP117去除內(nèi)毒素，避免非特異性免疫激活；

3. 核轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，72小時后T7E1酶切驗(yàn)證編輯效率＞35%。

• 結(jié)果示例：

• 提取的質(zhì)粒OD260/OD280=1.85，內(nèi)毒素未檢出；

• 基因編輯效率較含內(nèi)毒素質(zhì)粒提升25%，脫靶率降低15%。

3. 動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

1. 提取治療性基因表達(dá)質(zhì)粒（如pAAV-CMV-GFP），菌液量200 mL；

2. 通過DP117確保內(nèi)毒素＜0.1 EU/μg，避免小鼠注射后發(fā)熱反應(yīng)；

3. 尾靜脈注射C57BL/6小鼠（50 μg/只），7天后肝臟組織GFP熒光強(qiáng)度較含內(nèi)毒素質(zhì)粒組提升60%。

• 結(jié)果示例：

• 質(zhì)粒純度（OD260/OD280=1.92）及內(nèi)毒素水平符合FDA要求；

• 動物存活率100%，無炎癥反應(yīng)。

三、操作規(guī)范與注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

• 試劑配制：

1. 溶液P1：加入RNase A后混勻，4℃保存；

2. 漂洗液PW：按標(biāo)簽要求加入無水乙醇；

3. 洗脫液TB：65-70℃預(yù)熱以提高洗脫效率。

• 儀器校準(zhǔn)：

• 離心機(jī)：確保轉(zhuǎn)速誤差＜2%（8000 rpm對應(yīng)8228×g）；

• 移液器：定期校準(zhǔn)，避免體積誤差。

2. 操作流程

• 菌體收集：

1. 100-200 mL菌液8000 rpm離心3分鐘，棄上清；

2. 菌體沉淀用吸水紙吸干殘留培養(yǎng)基。

• 裂解與中和：

1. 加入8 mL溶液P1，渦旋振蕩至菌體懸?。?/p>

2. 加入8 mL溶液P2，溫和翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫放置5分鐘；

3. 加入8 mL溶液P4，立即翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫放置10分鐘。

• 過濾與純化：

1. 裂解液8000 rpm離心5分鐘，上清倒入過濾器CS1，緩慢推動推柄過濾；

2. 濾液加入0.3倍體積異丙醇，分兩次過吸附柱CP6；

3. 依次加入10 mL漂洗液PW、3 mL無水乙醇洗滌，8000 rpm離心2分鐘棄廢液；

4. 空柱8000 rpm離心5分鐘，去除乙醇?xì)埩簟?/p>

• 洗脫與保存：

1. 吸附柱置于新收集管，加入1-2 mL預(yù)熱洗脫液TB，室溫放置5分鐘；

2. 8000 rpm離心2分鐘，收集質(zhì)粒溶液，-20℃保存。

3. 實(shí)驗(yàn)后處理

• 廢棄物處理：

• 含內(nèi)毒素的菌體沉淀及濾液按生物危害品處理；

• 染菌的耗材121℃高壓滅菌30分鐘。

• 儀器維護(hù)：

• 吸附柱CP6為一次性耗材，禁止重復(fù)使用；

• 離心機(jī)轉(zhuǎn)子用70%乙醇擦拭，避免腐蝕。

四、常見問題解答

Q1：提取的質(zhì)粒濃度低如何解決？
A：

1. 檢查菌液OD600值，推薦高拷貝質(zhì)粒1.8-2.0，低拷貝質(zhì)粒2.0-2.5；

2. 確保菌體懸浮，避免裂解不充分；

3. 延長洗脫時間至10分鐘，或重復(fù)洗脫一次。

Q2：內(nèi)毒素殘留超標(biāo)怎么辦？
A：

1. 確認(rèn)溶液P4與CS1過濾器未過期；

2. 裂解液離心時間延長至15分鐘，確保內(nèi)毒素充分沉淀；

3. 使用LAL法驗(yàn)證內(nèi)毒素水平，必要時增加乙醇洗滌次數(shù)。

Q3：如何提高大質(zhì)粒（＞10 kb）的得率？
A：

1. 菌液量增加至300 mL，裂解液P1/P2/P4按比例增加至12 mL；

2. 洗脫液TB預(yù)熱至70℃，洗脫體積增加至3 mL；

3. 吸附后靜置10分鐘再離心，增強(qiáng)結(jié)合效率。